不僅僅要知道怎么做,還必須知道為什么這么做,透過(guò)現(xiàn)象看本質(zhì),透過(guò)原理,來(lái)解答SPE小柱操作的常見(jiàn)疑惑,今天小編就透過(guò)SPE背后的原理,告訴您SPE為什么有這樣哪樣的操作要求,一起來(lái)圍觀吧!
01
為什么SPE小柱操作要強(qiáng)調(diào)流速?
答:SPE小柱的填料裝填壓實(shí)以后,形成柱床,當(dāng)溶劑流過(guò)小柱,速度過(guò)快將導(dǎo)致兩個(gè)問(wèn)題,一個(gè)問(wèn)題是對(duì)于鍵合相填料,由于流速快而使得其不能充分浸潤(rùn)舒展,因而導(dǎo)致其保留活性降低;其次過(guò)快的流速導(dǎo)致小柱可能形成溝渠,使得填料未被充分浸潤(rùn),降低了吸附填料與樣品的接觸面積,影響了目標(biāo)物質(zhì)的傳質(zhì)過(guò)程,因而導(dǎo)致回收率降低。對(duì)于0.5-3.0mL/min的小柱流速通常是不會(huì)產(chǎn)生溝渠效應(yīng)的,另外溝渠的形成與柱床高度有關(guān),對(duì)于薄膜型的萃取膜片或者膜盤,由于橫截面大,柱床低,在高流速下不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的溝渠效應(yīng),因此適合在高流速的大體積水樣的富集,對(duì)于離子交換和特異性吸附,填料和分析目標(biāo)物的相互作用時(shí)間比常規(guī)小柱長(zhǎng),流速的控制,確保了好的保留效果。
溝渠效應(yīng)
SPE小柱的填料裝實(shí)后,當(dāng)通過(guò)小柱的流速較低時(shí),液體是以層流的方式通過(guò)填料層,將填料層浸潤(rùn)充分,濕潤(rùn)的液面截層逐級(jí)向前推進(jìn),見(jiàn)附圖;當(dāng)流速過(guò)大的時(shí)候,而柱床厚度較高時(shí),可能會(huì)在填料內(nèi)部形成溝渠通道,液流將通過(guò)溝渠,快速通過(guò)小柱,而使得填料的浸潤(rùn)變得不充分,這樣將使得體與填料的接觸面積大大降低,嚴(yán)重影響填料對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的保留效果。
圖一、SPE形成溝渠和田間灌溉的溝渠
圖二、SPE正常層流和溝流通過(guò)小柱填料
02
溶劑環(huán)境的pH怎么影響化合物在小柱上的保留,為什么我們要關(guān)注化合物的pKa值,在C18小柱中需要考慮這些因素嗎?
答:首先我們來(lái)說(shuō)一下,Ka指的是酸度系數(shù),又名酸離解常數(shù),可以理解為酸離解H離子的能力,而pKa=-lgKa,對(duì)于酸,在環(huán)境pH下存在如下平衡:
左邊的A-/HA,實(shí)際是指溶劑環(huán)境下,離子態(tài)和分子態(tài)的比例,右邊反映了左側(cè)兩者的轉(zhuǎn)化關(guān)系,取決于(pH-pKa)的數(shù)值大小。對(duì)于離子交換小柱,保持目標(biāo)物的離子化而非分子態(tài),是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),這對(duì)于離子交換作用機(jī)理的交換柱,將直接關(guān)系到其實(shí)驗(yàn)成敗。而對(duì)于硅膠鍵合C18小柱的萃取,由于硅膠(—SiOH)不能*“封端”,在pH大于4.0的情況下,硅膠都會(huì)帶上負(fù)電荷,因而會(huì)使得能電離的化合物與硅膠作用,增強(qiáng)了這種附帶的次級(jí)作用理(主作用力為非極性相互作用力),而使得此類物質(zhì)在硅膠-C18上的保留增強(qiáng),若只考慮C18的非極性作用力,必然會(huì)導(dǎo)致回收結(jié)果的不盡人意。
03
中性氧化鋁,酸性氧化鋁、堿性氧化鋁,怎么區(qū)分?
答:Al2O3 的主要作用力是通過(guò)金屬鋁中心與化合物的羥基形成氫鍵來(lái)吸附,或者通過(guò)離子交換作用。中性氧化鋁(Al-N):pH為6.5,中性氧化鋁主要通過(guò)鋁原子中心與帶有高負(fù)電荷的雜原子作用,如:N、O、P、S及富電子的芳香族化合物。
先理解酸化后和堿化后的氧化鋁,氧化鋁的性能變化:
Al2O3 + 6HCl = 2AlCl3 + 3H2O;
Al2O3 + 2NaOH= 2NaAlO2(偏鋁酸鈉) + H2O
酸化的氧化鋁和堿化的氧化鋁,使得氧化鋁表面的電荷性發(fā)生改變,如酸性氧化鋁帶正電荷的中心容易吸附陰離子,并且產(chǎn)生偶極作用,吸附極性化合物;而堿性則吸附極性和含陽(yáng)離子官能的化合物。
04
為什么在農(nóng)殘檢測(cè)過(guò)程中GCB常見(jiàn)于凈化模式,而不用于富集模式?
答:SPE的凈化模式常被用來(lái)吸附雜質(zhì),而富集模式常被用來(lái)吸附目標(biāo)物質(zhì),GCB是一種石墨化碳黑,是將炭黑在惰性氣氛下加熱到2700-3000℃烘焙而成,它由六個(gè)碳原子構(gòu)成平面六角形,并且層疊而成,對(duì)于芳香平面分子,很容易嵌入,而具有較強(qiáng)吸附芳香化合物的選擇性,對(duì)于其他分析物也有較好的吸附性能,填料的吸附與解吸附的性能將直接影響填料的使用范圍,對(duì)于GCB而言,其吸附性能較強(qiáng),但是解吸附的可逆性稍差,需要選擇合適強(qiáng)度的溶劑來(lái)釋放被吸附的物質(zhì),因而造成了解析溶劑匹配較為困難,由于其對(duì)色素等的優(yōu)xiu吸附性能,因而在農(nóng)殘樣品處理中,常用來(lái)吸附色素等雜質(zhì),而不是選擇用來(lái)保留目標(biāo)化合物。
05
HLB小柱為什么與傳統(tǒng)的硅膠鍵合C18不一樣,廠商建議可以不活化平衡?
答:SPE小柱活化平衡的目的有兩個(gè),一是使得鍵合官能團(tuán)填料的濕潤(rùn)和舒展,使之保持對(duì)目標(biāo)化合物的大吸附活性,另外一個(gè)目的就是去除填料本身可能引入的雜質(zhì)。我們知道硅膠鍵合C18,是在硅膠微球表面鍵合疏水性的C18官能團(tuán),為了使得其保持對(duì)目標(biāo)物的充分的吸附活性,需要在濕潤(rùn)的環(huán)境上樣,在填料表層形成的液膜(活化平衡)和上樣的溶劑分子有良好的相容性,目標(biāo)物在膜間進(jìn)行傳質(zhì),與鍵合C18發(fā)生疏水作用而保留,C18本身不具備水浸潤(rùn)性,直接上水樣,C18蜷縮,而且強(qiáng)的疏水性導(dǎo)致其與溶劑中的目標(biāo)物質(zhì)接觸傳質(zhì)變得困難,因此活化平衡*,HLB小柱采用聚合物改性材料,增加了親水基團(tuán),使得在上樣溶劑時(shí)就能很好的和水溶劑互溶,因而填料的官能團(tuán)能在上樣溶劑的環(huán)境下就與目標(biāo)物分子充分接觸,而發(fā)生傳質(zhì),使得目標(biāo)物質(zhì)被充分保留住。
06
淋洗步驟通常需要干燥,這個(gè)原因是什么?
答:淋洗液通常要干燥,主要作以下考量:
1.通常由于反相萃取在化合物的前處理中使用的比較多,正如反相色譜在色譜中作為常見(jiàn)的分離方法一樣,在反相萃取中的淋洗液常為水相或者含水的緩沖溶液,去除水份,可以便于后續(xù)干燥濃縮步驟。
2.有的項(xiàng)目,在淋洗步驟完成后,直接用一定體積的洗脫液,比如1ml的甲醇洗脫,此過(guò)程將洗脫與定容集為一步處理,前一步的處理必然對(duì)洗脫步驟的定量結(jié)果產(chǎn)生影響。
3.便是溶劑互溶問(wèn)題,當(dāng)淋洗步驟使用的溶劑極性與洗脫溶劑的極性差異較大時(shí),會(huì)產(chǎn)生乳化分層,洗脫阻力大,洗脫液被稀釋的風(fēng)險(xiǎn)等,導(dǎo)致洗脫效果的差異,以致于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的失敗。
07
我們?cè)谑褂霉枘z鍵合填料類型的色譜柱的時(shí)候,出于對(duì)色譜學(xué)的常識(shí),知道了硅膠鍵合填料一般廠商建議的pH使用范圍為2-8,那么對(duì)于使用硅膠鍵合的填料的固相萃取小柱,是否需要嚴(yán)格遵守這樣一條規(guī)定?
答:首先,我們需要了解到,廠家建議的pH2-8的耐受范圍,是為了保證色譜柱的正常使用壽命,硅膠鍵合相在超出耐受的pH范圍使用,會(huì)導(dǎo)致鍵合相與硅膠基質(zhì)的斷裂,因此會(huì)損害色譜柱柱效和保留特性,但是我們知道這個(gè)pH耐受值范圍外的溶劑對(duì)于色譜柱的影響,主要是一個(gè)積累性的過(guò)程,在溶劑沖刷下,逐漸溶解而導(dǎo)致色譜柱性能改變和不可逆,壽命減短。SPE小柱和色譜柱的一個(gè)差異就是,SPE是一次性消耗品,在耐受的溶劑范圍外,短暫時(shí)間的溶劑沖刷對(duì)于小柱的保留特性影響甚微,并不會(huì)導(dǎo)致其保留顯著差異,因此其使用的pH范圍更寬,一般可以在pH值范圍1-10使用,而不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)果的差異性。